Przez ponad 20 lat biolog morski Mary Hagedorn borykał się z pozornie trudnym problemem. Szukała sposobu na zamrożenie i rozmrożenie zarodków danio pręgowanego.
Ważne zwierzę doświadczalne, geny danio pręgowanego, zbliżone do genów ludzi na tyle blisko, że zostały wykorzystane do badania chorób, takich jak dystrofia mięśniowa i czerniak. Gdyby materiał rozmnożeniowy mógł zostać łatwo zamrożony i rozmrożony, badania te byłyby łatwiejsze do przeprowadzenia i powtórzenia, ponieważ badacze nie musieliby omijać harmonogramów tarła ani walczyć z dryfowaniem genetycznym.
Problem sprowadza się do reprodukcji ryb. Naukowcy z powodzeniem zamrażają - lub kriokonserwują, by użyć terminu technicznego - i rozmrażają żywe plemniki i jaja wielu zwierząt od dziesięcioleci. Ale jaja rybne rozwijają się poza ciałem rodzica, co stanowi wyzwanie fizjologiczne, które nie pojawia się, gdy pracujesz z komórkami bydła, a nawet ludzi. Jajko zawiera składniki odżywcze, których potrzebuje rozwijający się zarodek, a także ma własną zbroję, co oznacza, że jaja te są duże i często zamknięte w stosunkowo nieprzepuszczalnej błonie.
Mówiąc najprościej, jaja rybne są zwykle zbyt duże, aby w zwykłych okolicznościach szybko zamrozić lub rozmrozić. Hagedorn - który pracuje jako biolog naukowy w Smithsonian's National Zoo and Conservation Biology Institute's Center for Species Survival - porównuje je do planet. Jaja ssaków są zwykle bardziej podobne do drobniejszych członków naszego Układu Słonecznego - powiedzmy, Merkurego. Jajko danio pręgowanego znajduje się bliżej giganta takiego jak Jowisz.
„Jeśli nie zamrozisz tkanki w odpowiedni sposób, utworzą się w niej kryształy lodu, które przebiją komórki i zniszczą je” - mówi Hagedorn.
Spędziła 12 lat w poszukiwaniu obejścia, ostatecznie decydując się na nowatorskie rozwiązanie, które polegało na mikroiniekcji „krioprotektantu” (zasadniczo środka zapobiegającego zamarzaniu) do jaj, techniki, która pozwoliła temu środkowi ominąć membranę ochronną. Odpowiednio skalibrowane, aby uniknąć zatrucia komórek, te środki ochronne mogą pomóc zapewnić, że jajo równomiernie zeszkli się (stanie się szkliste), gdy zostanie zanurzone w kąpieli z ciekłym azotem.
„Jeśli nie zamrozisz tkanki w odpowiedni sposób, utworzą się w niej kryształy lodu, które przebijają komórki i niszczą je” - mówi Mary Hagedorn o problemie, jaki napotkała, próbując zamrozić embriony danio pręgowanego. (Encyklopedia życia / Bioimages) Chociaż proces ten mógł skutecznie wprowadzić zarodki ryb w stan zawieszonej animacji, ponowne ich nagrzewanie pozostało problemem. Gdy się ogrzewają, istnieje punkt pośredni między idealnym stanem szklistym a temperaturą pokojową, w którym kryształy lodu mogą zacząć się ponownie tworzyć. I te kryształy mogą uszkodzić materiał komórkowy, pozostawiając go niezdolnym do dalszego rozwoju.
„Musieliśmy rozmrozić je znacznie szybciej” - powiedział Hagedorn. „Korzystając z narzędzi, które mieliśmy w 2011 roku. . . Uderzyłem w ścianę. ”
Na chwilę się poddała.
I tak by pozostało, gdyby nie przypadkowe spotkanie na konferencji w sprawie kriokonserwacji w 2013 roku, gdzie usłyszała prezentację Johna Bischofa, profesora inżynierii mechanicznej na University of Minnesota.
Jak mówi Bischof, przedstawił niepowiązany temat dotyczący nanocząstek tlenku żelaza, które jego laboratorium wykorzystało do bezpiecznego ponownego ogrzania tkanki ludzkiej do przeszczepu. Jego badania kliknęły Hagedorn, co skłoniło ją do zastanowienia się nad jej potencjałem do zastosowań innych niż ssaki.
„Powiedziała: co możesz zrobić, aby pomóc mi z zarodkami”, wspomina Bischof.
To wstępne pytanie zrodziło złożoną, ciągłą interdyscyplinarną współpracę - taką, w której zarówno Hagedorn, jak i Bischof kładą nacisk na znaczenie pracy drugiej osoby.
Ich wyniki, opublikowane w tym tygodniu w czasopiśmie ACS Nano, wskazują, że w końcu można bezpiecznie ponownie ogrzać zamrożone zarodki rybne.
Inspiracją do ich pracy były wysiłki zmarłego obecnie naukowca Petera Mazura, który uważał, że możliwe jest ponowne uzbrojenie zamrożonych embrionów za pomocą laserów. (Tak, lasery.) Chociaż pomysł był potencjalnie zdrowy, wyzwaniem, powiedział mi Hagedorn, było uzyskanie laserów przenoszących ciepło do materiału biologicznego. Jednak wraz z innym naukowcem, Fritzem Kleinhansem, Mazur odkrył, że możliwe jest wprowadzenie do roztworu innej substancji z zarodkiem, która odbierałaby ciepło z lasera i przenosiła je do materii biologicznej.
W przypadku Mazura oznaczało to sadzę w postaci atramentu indyjskiego, substancji, która dobrze absorbuje i przenosi ciepło - i która, jak mówi Kleinhans, można po prostu kupić na Amazon.com. Jeśli na przykład zostanie umieszczony wokół zamrożonego zarodka myszy, pojedynczy impuls laserowy może niemal natychmiast doprowadzić materiał komórkowy do temperatury pokojowej, omijając pośrednią fazę ocieplenia, w której grożą tworzenie się kryształów lodu. Kleinhans mówi, że we wcześniejszej fazie pracy Hagedorna miała nadzieję, że technika ta może również zadziałać w przypadku zarodków danio pręgowanego. Niestety, były one nadal zbyt duże i zanim zewnętrzne ciepło dotarło do centrum, powstawały śmiertelne kryształy lodu.
Jednak, gdy Hagedorn, Bischof i ich współpracownicy piszą w swoim nowym artykule, istniał inny sposób. Rozprowadzanie atramentu z Indii na zewnątrz zarodka mogło nie być wystarczające, ale co, jeśli włożą do niego jakiś inny reagujący materiał przed zamrożeniem? Aby to zrobić, osiedlili się na złotych nanorodkach - maleńkich strukturach molekularnych, rzędach wielkości mniejszych niż ludzki włos - które mikroiniekcyjnie wraz ze środkami zapobiegającymi zamarzaniu do zarodka przed konserwacją, wykorzystali metody wypracowane przez Hagedorna lata temu.
Jak piszą naukowcy w swoim artykule: „Te nanocząstki mogą skutecznie wytwarzać ciepło, gdy długość fali lasera odpowiada energii rezonansu plazmonowego złotej nanocząsteczki”. To skomplikowany sposób stwierdzenia, że nanoporod może pochłonąć i wzmocnić energię z krótkiego błysku światła.
Złoto, podobnie jak wiele innych substancji, wykazuje inne właściwości w nanoskali niż w masie. Dobrze skalibrowany impuls lasera milisekundowego może nagle podgrzać zarodek za pomocą rozprowadzanego w nim złota, podgrzewając go z zadziwiającą szybkością 1, 4 x 10 7 ° C na minutę, prawie niezgłębioną temperaturą, którą można kontrolować w szybkich seriach, które naukowcy zatrudniają.
„W tym milisekundowym impulsie lasera zmieniasz płynny azot w temperaturę pokojową” - mówi Bischof. Co znamienne, w przeciwieństwie do jakiejkolwiek metody, którą Hagedorn próbował wcześniej, wyniki były wystarczająco gorące - i wystarczająco rozpowszechnione - aby z powodzeniem podgrzać cały zarodek danio pręgowanego jednocześnie.
Po przekroczeniu tej bariery pytania pozostały. Kluczowe wśród nich było to, czy zarodki te będą nadal żywe. Jak podają naukowcy w swoim artykule, znaczna część to, choć nie wszyscy. Spośród tych, które rozmrozili, 31 procent zrobiło to zaledwie godzinę po rozgrzaniu, 17 procent przekroczyło trzygodzinny znak, a zaledwie 10 procent nadal rozwijało się po 24-godzinnym znaku.
Choć może się to wydawać niewielkie, jest ono znacznie większe niż zerowy wskaźnik przeżycia, jaki przyniosły wcześniejsze metody. Hagedorn ma nadzieję, że przyszłe prace jeszcze bardziej „zwiększą” te liczby. I pozostaje pozytywna nawet w stosunku do 10 procent. „Ryba może wyprodukować miliony jaj, a gdybym z powodzeniem zamroził 10 procent tych jaj, to naprawdę dobra liczba” - mówi.
Oczywiście zmaganie się z milionami jaj wymagałoby dalszego przekształcenia procesu pod kątem wydajności. W tym momencie znaczna część tej pracy spoczywa na barkach Bischofa i innych w jego laboratorium, gdzie już trwają prace nad poprawą „wydajności” procesu, potencjalnie przekształcając go w przedsięwzięcie bardziej przemysłowe. „Myślę, że w nadchodzących latach opracowanych zostanie szereg technologii wspomagających, ” powiedział mi.
Jeśli ta praca się powiedzie, Hagedorn uważa, że może mieć inne zastosowania, które wykraczają daleko poza pokornego danio pręgowanego.
„Wielu hodowców akwakultury chce zamrozić ryby [materiał rozmnożeniowy], ponieważ pojawiają się tylko raz w roku” - powiedziała. „Masz ten boom i popiersie w prowadzeniu ich farm. Gdybyś mógł wyjąć zarodki z zamrażarki w bardziej zaplanowany sposób, dzięki temu jedzenie byłoby tańsze i bardziej niezawodne. ”
Może to również mieć wpływ na ochronę przyrody. Hagedorn, który dziś pracuje głównie na koralowcach, uważa, że może pomóc nam naprawić uszkodzone rafy. Sugeruje również, że może to ostatecznie przywrócić wyczerpane populacje żab, a może uratować również inne gatunki. Niezależnie od tego, dokąd zaprowadzi nas ta praca w przyszłości, stanowi ona świadectwo potencjału dzisiejszej współpracy naukowej.
„Na początku nie wydawało się to prawdziwe. Biologiczne znaczenie ma to, że moglibyśmy to zrobić, ale wydawało się, że nigdy nie uda nam się zebrać wszystkich elementów razem - powiedziała mi. „Gdybym nie usiadł obok Johna na tym spotkaniu, nigdy byśmy tego nie zrobili. Bez naszych wspólnych wysiłków - inżynierii i biologii - nie doszłoby do tego. ”
